Droplet Digital PCR可以检测Covid-19案例QPCR未命中

由Monica Herrera,MD和Carolyn Reifsnerder

截至2021年1月4日 - 疾病控制和预防中心近一年(CDC)和华盛顿州报告了美国的第一个确认的Covid-19案例 - 美国死亡损失从疾病达到351,000人们。1公共官员可以争辩在这个国家造成如此高案例的内容,但有一件事是肯定的:SARS-COV-2感染,就像它导致的疾病一样,很难检测,追踪和失败。

这个事实的一个原因是感染性不一定与症状相关。在许多情况下,患者可能在它们表现出症状之前或之后携带病毒,潜在地蔓延,而他们本身显然是健康的。并且,根据CDC,多达40%的SARS-COV-2载体不会在感染期间的任何点显示任何症状。2

对于那些表现出症状的人来说,延长潜伏期(2天至14天)为病毒创造了一个窗口,以蔓延未被发现。3.此外,不再显示任何临床症状的康复患者可能仍然携带病毒,并且处于从孤立过早释放的危险。4.

这些数据在一起表明,当局不能仅仅依赖于追踪,追踪和减轻人口中SARS-COV-2的扩散的临床症状。重要的是,医院可以获得高度敏感的诊断测试,这可以使疑似患者,医生和公共卫生当局确定有人是否正在携带对其社区构成威胁的水平的病毒。

可以准确地检测SARS-COV-2载体的社区,无论这些人是否显示症状,都可以更快地行动以检疫感染的个人,并强加有针对性的社会疏远规则和指导方针。遗憾的是,实时定量PCR(QPCR) - 目前用于检测患者病毒载荷的金标准方法 - 不敏感以提供最终的结果。

今天世界各地使用的大多数SARS-COV-2测试都是基于QPCR技术。但是,QPCR受到显着的变化 - 有两个原因。首先,结果只有定性,不是定量的。它们通过与标准曲线的比较来解释,这一代受到错误和偏见的影响。其次,用于定义测试结果的指标是不可靠的。QPCR通过计数RNA达到某种荧光强度阈值来确定SARS-COV-2 RNA浓度。但是通过PCR抑制剂可以减少扩增,从而破坏计数。在一起,这些问题降低了QPCR的敏感性 - 随着当局试图识别美国的Covid-19运营商,这些问题导致真正的担忧。

在大流行开始时,QPCR结果不一致,产生质量混乱和恐慌。两名早期患者停止显示Covid-19的症状和使用QPCR的两次测试阴性,促使他们从圣安东尼奥的一家医院发布。CDC后来确定患者仍然具有传染性。5.从那时起,医院很常见,以发出关于QPCR潜在不准确性的免责声明。

根据最近的研究,QPCR Covid诊断的假阳性率从10%到40%,它已成为反复测试疑似患者的常见做法,特别是如果它们的症状和测试结果矛盾。6.一些初始测试负面测试阳性的患者。由于基于QPCR的测试的不可靠性,宣布某人作为透明病毒的普遍标准是24小时收集的两个连续的阴性呼吸样本。7.

所有这些混淆都使得识别真正的Covid-19案件并使用该信息来实施目标缓解策略来挑战。对于医生,流行病学家和公职人员有效地完成工作,他们需要能够确定个人是否真正携带SARS-COV-2。

更敏感的工具

一个高度敏感的工具 - 液滴数字PCR(DDPCR) - 可以帮助增加QPCR时增加诊断确定性。

与QPCR不同,DDPCR提供无关的病毒滴度,与标准曲线无关。它对PCR抑制剂的影响也不太敏感,这使DDPCR技术更敏感。该技术本身已被用于诊所用于监测癌症患者中的核酸生物标志物,并在研究实验室中计算植物中的病毒滴度。当大流行激烈时,研究人员很快发现DDPCR技术非常适合检测和监测SARS-COV-2病毒滴度在呼吸样本中。

在实践中,DDPCR涉及将样品分成成千上万的纳米型尺寸液滴,其中每种单独的PCR反应。液滴包含感兴趣的序列,例如来自SARS-COV-2病毒体的序列,荧光荧光,而不含该序列的液滴仅发出弱,背景上卷曲。通过计算所有液滴中的明亮,荧光液滴的数量,可以计算样品中病毒的浓度。该方法的强度来自定量结果如何用于提供更准确的定性诊断。8.液滴数码PCR是高度敏感的,使技术理想地解释QPCR结果的确认,并独立促进患者病毒的早期检测和持续监测。

许多研究人员在大流行病之前在他们的实验室中进行了DDPCR平台,这些研究人员患者研究了SARS-COV-2动力学,将它们的发现与临床症状相关。关注QPCR试验中误阳性的发病率,并且已经熟悉DDPCR在其他应用中的卓越敏感性,一些研究人员开始比较两种平台在人类标本中检测SARS-COV-2 RNA的能力。

中国武汉大学的研究人员研究了QPCR和DDPCR检测疑似和康复患者病毒的敏感性。9.基于患有医院临床症状的临床症状的无症状载体和阴性QPCR试验的患病率,研究团队担心使用QPCR检测病毒的医生缺少大量案例。与此同时,担心康复患者在病毒清除之前从医院释放,将周围的人们暴露在活病毒。

在他们的研究中,研究人员测试了63名疑似门诊患者的喉头拭子,14例假释患者。使用QPCR和DDPCR技术同时测试每个样品,具有相同的引物和探针。在63名疑似患者中,检测到21例阳性病例和DDPCR检测到49.二十四名患者最初用QPCR测试阴性,但DDPCR阳性后期患有疾病的临床症状。他们最终在2天内使用QPCR入住并测试过阳性,进入他们的住院住宿。另外七名样品产生误报的患者被隔离,最后用QPCR进行阳性,以后或更长时间。

武汉研究人员还分别进行了串行稀释度以分别测试QPCR和DDPCR的检测限。QPCR能够检测每次反应的病毒序列的837.2份低至837.2份,而DDPCR能够检测每次反应的低至1.8份。在武汉大学的第二次研究中,研究人员缩小了DDPCR在检测冠状病毒方面的敏感性的参数。10.DDPCR能够在10中检测SARS-COV-2-410.-3稀释的患者样品,而QPCR不是。

同时,约翰霍普金斯大学的研究人员涉及QPCR产生假阳性结果的潜力,特别是在对个体患者的重复测试的情况下。8.3月11日至2020年5月11日,约翰霍金斯医院微生物实验室每天持续约500个Covid-19测试。大约2,194名疑似患者经过多次测试,通常会产生不一致或意外的结果。例如,使用QPCR反复测试的1,788名疑似患者每次都会产生负面结果,但是当研究人员使用DDPCR技术测试了198个这些负面标本时,11呈阳性。

米兰大学的研究进一步证明了DDPCR从Covid-19怀疑患者中检测到QPCR阴性鼻咽拭子中的SARS-COV-2的能力。11.研究人员的内部DDPCR测定检测到19名以前使用QPCR测试阴性的19例患者的鼻咽样本中的SARS-COV-2 RNA。这些患者的十五个患者发育肺炎和14例表现出严重感染的迹象。

Monica Herrara,MD,Bio-Rad Laboratories。

总之,这些数据突出显示DDPCR的效用作为QPCR的补充,能够检测疑似或康复患者的低病毒载量。令人担忧的是,关于每次新诊断释放的准确性,DDPCR可以帮助实验室在诊断Covid-19案件时对其结果的质量感到充满信心。

Carolyn Reifsnerder,Bio-Rad Laboratories。

一个敏感的Covid-19诊断不仅有助于检测案例,而且还有助于医生评估患者是否可能将病毒传播给他人。它可以帮助指导患者在将病毒传播给他人之前保留检疫的决定。它还可以帮助政府当局更好地追踪SARS-COV-2运营商,可能会使更具体的关机订单和资源分布给需要最有帮助的区域。总之,与治疗剂和疫苗相结合,DDPCR技术可能有助于减轻病毒的扩散。

阅读更多关于使用DDPCR以监控更大人口的Covid-19,阅读在废水中测试SARS-COV-2

Monica Herrera,MD,是Bio-rad Laboratories数字生物学群中的人类遗传和传染病的计划领导。

Carolyn Reifsnyder.是Bio-Rad Laboratories数字生物学群体的全球产品营销总监。

特色图片:技术人员使用Bio-Rad的QX200液滴数码PCR系统。

参考

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